«история моего эко»

Клетки растут в биореакторах объемом несколько тысяч литров

Культивирование клеток в биореакторе. Фото с сайта process-worldwide.com

В медицине и фармакологии эмбриональные клеточные линии в настоящее время используются при создании вакцин (векторных или живых) от кори, краснухи, паротита, гепатита А, бешенства, ветряной оспы, коронавируса. Человеческие клеточные линии нужны для размножения вируса, который потом используют в прививке. Ведь вирусам, в отличие бактерий, нужен «хозяин», и этим «хозяином» становятся клетки клеточной линии.

Их также используют для создания лекарственных препаратов от ревматоидного артрита, гемофилии и муковисцидоза. Кроме того, линию НЕК-293 применяют в исследованиях, посвященных поиску раковых терапий. На ней же выращивают адено-ассоциированный вирус, который служит вектором для доставки генов в препарате «Золгенсма», который применяют при терапии спинально-мышечной атрофии. 

Эмбриональные клетки действительно могут делиться практически бесконечно в условиях, созданных для этого в лабораториях. Сторонники этого метода в качестве аргумента, оправдывающего использование абортивного материала, говорят: клеточные культуры, которые используются сегодня, получились в результате длительного деления и уже фактически не являются частью организма некогда абортированного ребенка.

Получение клеточной линии выглядит следующим образом. Ткань или орган, из клеток которых предстоит в будущем развивать клеточную линию, забирают с соблюдением условий асептики, помещают в стерильный солевой раствор и транспортируют в специализированную лабораторию.

В лаборатории ткани и органы тщательно изучают, в том числе на предмет возможного инфицирования. Если установлено, что они «чистые», скальпелем или ножницами измельчают до кусочков размерами не более 1-3 мм, тщательно отмывают от клеток крови в нескольких сменах стерильных растворов, а затем помещают в растворы специальных ферментов, позволяющих изолировать отдельные клетки.

Собственно, эти самые клетки, которые удается выделить с помощью измельчения (иногда для этого даже может понадобиться своеобразное «сито»,  через которое фильтруют полученный из тканей или органов раствор) – это и есть первичная клеточная культура. Ее можно начинать «растить» с помощью питательной среды и ряда специальных технологий.

Большинство клеточных культур растут в так называемом монослое – то есть на дне пластикового или стеклянного контейнера, располагаясь слоем толщиной в одну клетку. Чтобы они размножались быстрее и эффективнее, были придуманы специальные многоэтажные контейнеры.  (Вот так например это выглядит. )

Некоторым типам клеток требуется постоянное перемешивание  – для них были изобретены «шейкеры», которые встряхивают сосуды с клетками. Например, в Италии для создания вакцин в заводских условиях используют одновременно 28 тысяч особых роллерных флаконов. Автоматика при этом контролирует температуру и скорость вращения. А когда на заводе заменили гладкие стеклянные флаконы на гофрированные из пластика, увеличив площадь поверхности, получили двадцатикратный прирост клеток, а удвоение клеточной популяции происходит всего за 8 с небольшим часов.

Но лучше всего работает технология, при которой клетки размножаются в виде суспензии в специальном биореакторе. Такие реакторы объемом до 8 тысяч литров работают в странах Европы и в США.

При этом, собственно клетки эмбриональной линии в конечный продукт (прививку) попадать не должны.

Когда вирус размножится в достаточном количестве, его разными средствами отделяют от клеточной культуры, очищают от примесей. Для этого могут использовать разные методы – электрофорез, различные химические вещества, окрашивание и даже многоуровневая фильтрация. Полученный же чистый вирус или его фрагменты добавляют в вакцину вместе с другими веществами, которые обеспечат ее консервацию, стабильность и в дальнейшем – необходимое воздействие на организм.

Фрагментация эмбриона — что это?

Фрагментация эмбриона — это отделение безъядерных (ануклеарных) фрагментов клеток эмбриона. При оценке качества эмбриона оценивается степень фрагментации выраженная в процентах.

Если фрагментация составляет более 35%, это может говорить о плохом качестве эмбриона, в дальнейшем приводящая к деградации эмбриона и остановке развития. Такой эмбрион не является перспективным для наступления беременности. При оценке качества эмбрионов, все показатели записываются в эмбриологический протокол для того, чтобы впоследствии выбрать наиболее перспективный эмбрион для переноса.

На 5 сутки при благополучном развитии эмбрион образует бластоцисту, состоящую из внутриклеточной массы и трофэктодермы. На данном этапе развития оценивается размер бластоцисты (степень экспансии), а также качество ВКМ и ТЭ, в соответствии с общепринятой классификацией.

Качество эмбрионов зависит от многих факторов. От качества исходно полученных клеток, от эмбриологического этапа, от генетических факторов, от возраста пациентов и особенностей анамнеза пациентов и пр. В случае получения плохих эмбрионов выбирается индивидуальная тактика. Эмбрион плохого качества имеет сниженные шансы на имплантацию и наступление беременности. Перенос такого эмбриона возможен, например, в случае отсутствия альтернативных вариантов.

А есть ли разница?

Вывод однозначен: целью должно быть не наступление беременности, а рождение здорового ребенка.

Почему всего один? Потому что на чаше весов помимо материнского счастья в квадрате есть и возможные риски и осложнения многоплодной беременности.  Интересно, что будущие мамы это осознают, и все чаще за умилительными заключениями «двойняшки  это же так мило» или озабоченными «как же потом с ними справляться»  звучит  «боюсь, что не смогу доносить», «беспокоюсь за здоровье малышей». Разумеется, эти беспокойства не беспочвенны: к сожалению, беременность двойней труднее доносить до срока плановых родов, что чревато осложнениями из-за недоношенности.

Проведенные большие исследования изучали частоту живорождений детей после переноса одного и двух эмбрионов. В равных группах она оказалась практически одинаковая – случаев рождения детей после переноса двух эмбрионов всего на пару процентов больше, чем после одного.

Второй день после оплодотворения

Следующая стадия развития эмбриона – деление клеток пронуклеуса. Образовавшиеся в результате деления новые структуры называют бластомерами. Они, в свою очередь, также продолжают делиться.

Оценка качества эмбрионов при ЭКО на этом этапе происходит по следующим параметрам:

• размер новых клеток;
• форма дочерних клеток;
• степень фрагментации (объем фрагментов цитоплазмы внутри зародыша, у которых отсутствуют пронуклеоли).

Если количество бластомеров увеличивается, но степень фрагментации при этом уменьшается, такие эмбрионы считаются более качественными.

Для оценки качества эмбрионов при ЭКО врачи применяют следующую классификацию:

• качественный эмбрион, у которого отсутствуют безъядерные элементы;
• зародыш среднего качества со степенью фрагментации менее 20%;
• зародыш удовлетворительного качества со степенью фрагментации от 20 до 50%;
• зародыш низкого качества, у него количество безъядерных фрагментов превышает 50%.

Вместе с латинскими буквами также используются цифровые обозначения, они соответствуют количеству бластомеров.

День четвертый

Если бы развитие эмбриона происходило в естественных условиях, он попал бы в полость матки на четвертый день после оплодотворения. До этого времени он находится в маточной трубе.

На четвертый день зародыш состоит из 10-16 бластомеров. Он становится более компактным – занимает небольшой объем относительно количества клеток. Его поверхность выглядит более гладкой, чем на третий день.

Морула – так называется стадия развития эмбриона на данном этапе. В переводе это означает «тутовая ягода». Так эмбриологи назвали его именно за внешнее сходство с этой ягодой.

Заканчивается данная стадия кавитацией. Так называется процесс образования полости внутри эмбриона.

День первый

Сразу после оплодотворения доктор проверяет признаки того, что процедура ИКСИ, ПИКСИ или ЭКО проходит успешно. Для этого он смотрит, как выглядят пронуклеусы, и оценивает их:

• наличие;
• количество;
• внутреннюю структуру;
• симметричность;
• внешний вид.

Пронуклеусы – это ядра половых клеток (мужских и женских), которые еще не слились. Изучая их вид, можно оценивать перспективы, качество и жизнедеятельность будущих эмбрионов.

Критерии нормы:

• пронуклеусов должно быть два;
• они должны располагаться рядом;
• их размеры должны быть одинаковыми;
• внутри должны визуализироваться «ядрышки» (пронуклеоли);
• «ядрышки» должны иметь правильное расположение и количество.

На данном этапе развития эмбрионов может формироваться множество патологий, которые ведут к их гибели. Например:

• присутствие одного пронуклеуса вместо двух (оплодотворение не состоится);
• наличие трех пронуклеусов (эмбрион нежизнеспособен, так как будет иметь тройной хромосомный набор).

Плохие эмбрионы сразу отбраковывают. Нет смысла их пересаживать. Даже если они не погибают на этапе культивации, организм женщины сам отторгает такие зародыши. В результате если беременность наступает, она очень быстро прерывается. Это происходит уже в первые недели гестации.

Гестация, гестационный возраст новорожденного (от лат. gestatio ношение) — количество полных недель беременности, прошедших между первыми сутками последней менструации роженицы и моментом перерезания пуповины во время родов.

Пятый день после оплодотворения

Эмбрион к этому периоду переходит в стадию формирования бластоцисты. Иными словами, полость в клетке зародыша продолжает увеличиваться и достигает 50% от исходного объема. Клетки внутри эмбриона начинают трансформироваться, в результате чего образуются:

• трофобласты – они располагаются на границе эмбриона и способствуют закреплению зародыша на стенках матки, из этих структур в последующем будет сформирована плацента;
• эмбриобласты – внутренние структуры, из которых в будущем станут формироваться ткани и органы плода.

Как правило, после завершения формирования тробобластов и эмбриобластов зародыш пересаживают в матку женщины. Также на данном этапе можно проводить генетические исследования для выявления возможных патологий будущего плода.

Как связаны беременность и вес?

На первый взгляд кажется, что масса тела никак не влияет на репродуктивную функцию, но это не так. Сам по себе лишний вес не является противопоказанием к беременности, однако у таких пациенток зачатие происходит намного трудней, чем у женщин с нормальной массой тела. Дело в том, что процесс созревания яйцеклетки и обмен веществ тесно связаны между собой, и нарушения в метаболизме влекут за собой снижение качества ооцитов.

Для определения наличия и степени ожирения высчитывают индекс массы тела — соотношение роста и веса. Незначительное превышение нормальных значений не влияет на результат протокола ЭКО, но если получившиеся показатели существенно превосходят его, пациентка находится в зоне риска. По этой причине женщина должна стабилизировать вес перед тем, как вступить в программу ЭКО.

Особое внимание также следует обратить на зону талии. У некоторых женщин с нормальным индексом массы тела есть абдоминальное ожирение — жировые отложение сосредоточены в области живота

Проверить это очень просто: такой диагноз ставят, если объем талии превышает 80 см. Женщинам с подобными показателями перед прохождением протокола ЭКО следует обязательно проконсультироваться со специалистом.

Почему так важно снизить вес перед ЭКО?

В ходе протокола ЭКО производится забор яйцеклеток, после оплодотворения которых возникают эмбрионы. При нарушениях метаболизма страдает качество ооцитов, что негативно сказывается и на состоянии получаемых из них эмбрионов. Во избежание подобных негативных последствий женщине с избыточным весом перед протоколом ЭКО необходимо похудеть.

Безусловно, при очень высоких показателях ожирения оперативно сбросить большое количество килограммаов не получится, кроме того, быстрое похудение может навредить здоровью. Однако даже незначительное снижение веса под четким контролем врача позволяет ощутимо улучшить метаболизм, следовательно, и качество яйцеклеток. Пациентка должна строго придерживаться разработанной специалистом индивидуальной программы похудения, и тогда положительный результат не заставит себя долго ждать.

Перед планированием беременности женщина с избыточным весом проходит диагностику, которая включает:

• измерение массы тела, роста;
• расчет индекса массы тела;
• измерение окружности талии;
• контроль за артериальным давлением;
• выявление нарушений углеводного обмена — проводят тест на толерантность к глюкозе, уровень инсулина, выясняют другие необходимые показатели;
• биохимический анализ крови;
• УЗИ брюшной полости;
• тест на гормоны;
• определение уровня витамина D.

Выбор оптимального момента для подсадки эмбриона

Как правило, в клиниках по лечению бесплодия практикуется подсадка эмбриона на вторые или третьи сутки после культивирования. На практике не было выявлено существенного влияния на результат беременности при переносе на вторые или на третьи сутки. Момент выбирают, исходя из анализа интенсивности, а также равномерности дробления эмбрионов. В случае, если на вторые сутки выбор сделать не получается – подсадка выполняется на следующий день.

Пациентке советуют предварительно позвонить в центр по лечению бесплодия и уточнить, как происходит оплодотворение яйцеклетки. Врач сообщает, когда ей следует подойти для процедуры переноса эмбрионов в матку.

Аменорея, маточное кровотечение, кандидоз

— Какие именно гинекологические проблемы могут быть вызваны переживанием острого стресса и через какой период это проявится?

— Первым тревожным звонком обычно становятся нарушения менструального цикла, которые могут наблюдаться сразу же после перенесенного стресса

• удлинение цикла: задержка менструации на 10 и более дней;
• укорочение цикла: начало менструации на 10 и более дней раньше, чем обычно (нормальная длительность менструального цикла — 24−38 дней; межцикловые различия длительности цикла в норме могут быть до 10 дней);
• полное прекращение менструаций: функциональная гипоталамическая аменорея (раньше эту проблему называли «аменорея военного времени»);
• обильное маточное кровотечение (не только во время месячных): нарушение гормональной регуляции менструального цикла может приводить к ановуляции (когда яйцеклетка не «выходит» из фолликула в яичнике), эндометрий (внутренняя слизистая оболочка матки) в такой ситуации избыточно разрастается, что и приводит к обильному кровотечению. Это серьезная проблема, которую ни в коем случае нельзя игнорировать: иногда кровотечения могут быть настолько массивными, что требуется хирургическое вмешательство и переливание крови.

Вторая частая патология — нарушение биоценоза влагалища. Кандидозный кольпит — воспаление слизистой оболочки влагалища, которое вызывается микроскопическими дрожжеподобными грибами рода Candida.

Научные статьи в журнале Американского общества микробиологии Clinical and Vaccine Immunology подтверждают, что психологический стресс, особенно хронический, подавляет иммунную защиту организма и способствует избыточному размножению грибов Candida.

Острый стресс, особенно с нарушением сна и изменением режима питания, может спровоцировать проявления кандидоза.

Полезная информация

ПГД рекомендовано:

• При бесплодии, привычном невынашивании беременности
• При неоднократных неудачных попытках ЭКО
• При возрасте женщины старше 35 лет
• При наличии высокого риска передачи наследственных заболеваний

Техника выполнения ПГД

Для проведения преимплантационной генетической диагностики эмбрионам проводится биопсия на 3 день (биопсия бластомера) или на 5 день (биопсия трофэктодермы) их развития.

На третий день развития эмбрион, как правило, состоит из восьми бластомеров (клеток). Биопсия эмбриона на данной стадии представляет собой отделение одной клетки от эмбриона. При этом существует риск повреждения эмбриона, что влечет за собой снижение потенциала его дальнейшего развития. Кроме того, на этой стадии эмбрионы имеют высокий уровень мозаицизма (до 55%), то есть наличия хотя бы одной клетки, отличающейся по хромосомному набору (генетическому составу) от остальных, что обуславливает риск ложнопложительных и ложноотрицательных результатов диагностики.

Более распространенной в современной практике является биопсия эмбриона на пятый день развития. В этот момент эмбрион уже находится в стадии бластоцисты (ранней стадии развития зародыша), состоящей из двух слоев клеток: внутриклеточной массы и трофэктодермы. Впоследствии трофэктодерма участвует в образовании плаценты, а внутриклеточная масса — в образовании плода. В процессе биопсии эмбриолог с помощью микроинструментов забирает сразу несколько клеток трофэктодермы, внезародышевой ткани. Это существенно снижает риск повреждения эмбриона, риск наличия мозаицизма, получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования, обеспечивает безопасность процедуры и повышает точность диагностики.

Оборудование для проведения безопасного ПГД

В Доме Планирования Семьи отдается преимущество проведению биопсии эмбрионов на 5 день. Техника проведения такой биопсии требует от эмбриолога значительного опыта и наличия высококлассного оборудования в лаборатории.

Биопсия проводится экспертами-эмбриологами на современном и надежном оборудовании — инвертированном микроскопе Olympus, оснащенном микроманипуляторами Narishige и активным лазером OCTAX NaviLase. При проведении PGD этот лазер позволяет максимально точно и безопасно отделить одну или несколько клеток (биоптат) от эмбриона. OCTAX NaviLase минимизирует вредное воздействие на клетку за счет низкой инвазивности и минимального облучения, и является предметом гордости Эмбриологической лаборатории клиники.

Точность предимплантационной диагностики

Генетический анализ на хромосомный набор может выполняться разными методами, в числе которых метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ), aCGH (метод сравнительной геномной гибридизации) и NGS (метод полногеномного секвенирования). Наша Клиника использует только самые современные методы aCGH и NGS, обеспечивающие информативные и надежные результаты. Слаженная работа команды репродуктологов, эмбриологов и генетиков позволяет достичь высокий процент наступления беременности в Клинике.

Стоимость преимплантационной генетической диагностики

Указаны цены на самые востребованные услуги со скидкой 30%, которая действует при оплате наличными или банковской картой. Вы можете обслуживаться по полису ДМС, оплачивать отдельно каждый визит, заключить договор на программу ЭКО или внести депозит. Услуги оказываются на основании заключенного договора.

Принимаются к оплате пластиковые карты MasterCard, VISA, Maestro, МИР. Также доступна бесконтактная оплата картами Apple Pay, Google Pay и Android Pay.

Работаем круглосуточно 24/7

Для Вашего удобства мы работаем 24 часа 7 дней в неделю

Индивидуальный подход ко всем пациентам

Мы учитываем особенности каждого пациента и каждой супружеской пары.

Западные стандарты лечения

Все решения находятся в рамках протоколов доказательной медицины.

Сотрудничество с ведущими клиниками

Наши врачи плотно сотрудничают с коллегами из Европы, США и Израиля.

Обследования перед ЭКО

Перед проведением экстракорпорального оплодотворения обоим родителям назначается комплекс диагностических процедур, целью которых является:

• Определение причины бесплодия у одного или обоих родителей;
• Выявление возможных заболеваний, способных негативно сказаться на эффективности ЭКО или нанести ущерб матери и ее будущему ребенку;
• Оценка вероятности наступления беременности естественным образом и при экстракорпоральном оплодотворении;
• Оценка совместимости генетического материала обоих родителей для исключения резус-конфликта;
• Выбор наиболее эффективного протокола ЭКО, дополнительных репродуктивных технологий для повышения шанса наступления беременности.

Стандартный комплекс диагностики для женщин перед ЭКО включает следующие процедуры:

Анализы крови – клинический, биохимический (на белок, холестерин, мочевину, креатинин и т. д.), гормональный (АМГ, ФСГ, ЛГ и другие), на инфекции (ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис, TORCH-комплекс), на резус-фактор и группу крови;

Мазки из цервикального канала и влагалища – микроскопическое исследование, посев на мико- и уреплазму, цитологическое исследование соскоба с шейки матки, исследование на ДНК хламидии, цитомегаловируса, герпесвируса;

Функциональные обследования – флюорография, электрокардиограмма, ультразвуковое исследование щитовидной и паращитовидной желез, органов малого таза, груди, маммография (для женщин старше 35 лет).

Будущий отец также должен пройти стандартный цикл диагностических обследований, включающий:

• Анализы крови – на группу крови и резус-фактор, госпитальный комплекс инфекций (ВИЧ, сифилис, гепатиты В и С);
• Спермограмму – исследование спермы на выявление количества и качества сперматозоидов, их морфологического строения, подвижности и т. д.;
• MAP-тест – исследование спермы на содержание антиспермальных антител, являющихся признаком аутоиммунного бесплодия у мужчин;
• Мазки из уретрального канала – на определение ДНК хламидии, цитомегаловируса, герпесвирусов, для микроскопического исследования отделяемого уретры, посев на мико- и уреплазму.

По результатам обследований врач (гинеколог или андролог) составляет заключение, в котором определяет причину бесплодия, наличие возможных заболеваний у родителей, шанс на успешное наступление беременности. При необходимости он может назначить прохождение дополнительных диагностических процедур для уточнения диагноза.

Классификация эмбрионов на стадии бластоцисты.D.Gardner, et al., 1999.

Степень зрелости бластоцисты:

• 1 степень — ранняя бластоциста, полость бластоцисты меньше половины объема эмбриона.
• 2 степень — полость бластоцисты больше половины объема эмбриона.
• 3 степень — полная бластоциста. Полость полностью занимает объем эмбриона.
• 4 степень — расширенная бластоциста. Полость бластоцисты становится больше и начинает истончаться ZP.
• 5 степень — трофэктодерма ничинает проникать через ZP.
• 6 степень — вылупившаяся бластоциста, покинувшая ZP.

Внутриклеточная масса (ВКМ):

• А — плотно упакованная с большим количеством клеток.
• В — более свободная группировка среднего количества клеток.
• С — незначительное количество клеток